Главная


доставка цветов краснодар

Цитотоксические лимфоциты мышей с опухолями в сингенной системе

Для работы используют солидную, индуцированную бензпиреном у мышей СВА, опухоль (BP-ROS/Ol). Гистологически опухоль представляет собой недифференцированную полиморфно-клеточную саркому.

Иммунизация.

Самкам мышей СВА вводят внутримышечно в мышцы задней конечности 0,5х106 клеток опухоли BP. Через 10 дней извлекают лимфатические узлы.

Клетки лимфатических узлов в качестве эффекторных клеток.

Лимфатические узлы обрабатывают как было описано выше, ингвинальные узлы с той стороны, где была привита опухоль, отбрасывают вследствие инфильтрации опухолевыми клетками. Готовят суспензию 10х106 клеток/мл.

Опухолевые клетки в качестве клеток-мишеней. В данном случае опухолевые клетки подготавливают так же, как фибробласты (см. выше). Опухолевую ткань от трех животных измельчают, трипсинизируют и культивируют. Клетки 20х106 в 10 мл среды II переносят в культуральный сосуд на 200 мл и обрабатывают 10% С02 в водонасыщенной атмосфере. Через 3—4 дня появляются отдельные островки адгезиро-вавших опухолевых клеток, которые пассируют до получения компактного монослоя клеточной культуры. Клетки обрабатывают трипсином (1 г/л), отмывают, 5х106 клеток инкубируют 45 мин при 37°С с 3,7 мБк 51 [Сг]. Клетки трижды отмывают, готовят суспензию из расчета 5х105 клеток/мл.

Высвобождение 51[Сг].

К 0,1 мл клеток-мишеней добавляют различные количества эффекторных клеток для получения различных соотношений э — м. В качестве контроля используют клетки лимфатических узлов неиммунизированных животных. Пробы инкубируют 6 ч при 37 °С при постоянном встряхивании. После центрифугирования отбирают аликвоты по 0,5 мл и определяют радиоактивность в гамма-счетчике. Проводят так называемый "нуль-контроль" (клетки-мишени) только со средой, для определения уровня фона в начале анализа, в конце анализа и контроль максимального высвобождения радиоактивности при лизисе клеток тритоном Х-100 (см. выше).

Цитотоктичность рассчитывают по уравнению № 6 (см. раздел «Расчет»). В случае вышеописанной модели при соотношении э: м, равном 100: 1, наблюдается 36% цитолиз. Максимальная высвобождаемая радиоактивность составляет 84%. Это означает, что 16% радиоактивности прочно связываются с клетками.

Микроцитотоксический тест с визуальной оценкой результатов.

Этот тест проводят на микропланшетах (Falcon № 3034, США). Клетки-мишени не метят. В лунки вносят приблизительно по 500 клеток BP в 20 мкл среды. Через 24 часа надосадочную фракцию отсасывают, около 200 клеток при этом остаются адгезированными к поверхности микропланшета. В 20 мкл вносят в лунки 1х105 лимфоцитов, что соответствует соотношению 500:1, закрывают камеру крышкой и инкубируют в атмосфере с 10% СО2 в течение 48 ч. После двукратной отмывки фиксируют препарат метиловым спиртом, окрашивают раствором Гимза и подсчитывают количество оставшихся в живых клеток-мишеней.

Результаты оценивают по уравнению 4 (см. раздел «Расчет») с той лишь разницей, что вместо импульсов подсчитывают клетки. Значение цитотоксичности составляет около 45%.

Оценка результатов, модификации. Клетки BP можно получать из асцитической жидкости после внутрибрюшинного заражения животных. Если клетки не растут в полости брюшины, следует поместить кусочек ткани в культуральный сосуд с сывороткой эмбрионов коров. Через некоторое время образуется монослой клеток, которой можно субкультивировать. Микроцитотоксический тест также проводят с радиоактивной меткой. Измеряют радиоактивность культуральной среды или адгезировавших клеток. Выявление живых клеток можно упростить при помощи проекционного микроскопа. В качестве клеток-мишеней можно использовать макрофаги и тимоциты. По сравнению с фибробластами тимоциты более устойчивы к цитолизу. Макрофаги можно использовать в качестве клеток-мишеней после их обработки поли-L-лизином. Предынкубация клеток-мишеней в течение 4 ч при 37 °С помогает удалить связанный с мембранами избыток хрома. Наличие зависимости между числом отмывок эффекторных клеток и степенью цитолиза указывает на существование сывороточных факторов торможения цитолиза. Предварительной инкубацией эффекторных клеток в течение 12 часов при 37°С большую часть ингибиторов цитолиза можно удалить. Влияние различных радиоактивных соединений на величину цитотоксичности определяют при помощи клеток-мишеней, меченных двойной радиометкой. Для стандартизации теста с успехом используют хранящиеся на холоде препараты клеток. Монослой клеток-мишеней удобнее в работе, чем суспензия клеток.