Главная


Жидкие аминокислоты twinlab - Купить спортивное питание

Анафилактические реакции. Методы in vitro

Исследования на тучных клетках крыс

Материалы и оборудование. Для работы необходимы однополые крысы весом 200—250 г, пипетки, шприцы для инъекций, центрифужные пробирки (силиконизированные), камера Тома, настольная центрифуга, микроскоп, флюориметр [в качестве замены можно использовать Specol с приставкой для измерения флюоресценции FK и фотоувеличителем (PhoM), ртутную лампу на 40 Вт (Osram), фильтр GG-13, возбуждение на длине волны 365 нм, эмиссия на 450 нм]; устройство для регистрации сокращений изолированного отрезка толстого кишечника морской свинки; буфер для тучных клеток [8,417 г NaCl, 0,201 г КСl, 0,360 г глюкозы, довести до 1000,0 мл фосфатным буфером Серенсена с рН 7,2, если необходимы ионы Са2+, к 1000 мл буфера для тучных клеток добавляют 0,147 г СаС12x2Н20]; раствор Тироде [9 г NaCl, 1 г глюкозы, 0,2 г КС1, 0,3 г СаСl2, 0,1 г MgCl2, 5 мл 0,2 М раствора трисаминометана; дистиллированная вода до 1,0 л], этиловый эфир; спиртовой раствор нейтрального красного (0,2%) или метиленового синего (0,025%); 2,5% раствор толуидинового синего в 25% уксусной кислоте; 1 М NaOH; 3 М HCl; 0,1 М HCl для калибровочной кривой, ЧСА; орто-фталевый альдегид (ОФТ)—0,05% раствор в метаноле; препарат 48/80 (1 мкг/мл приблизительно для 50% высвобождения гистамина); протамиисульфат (Protamin forte) (37,5 мг/мл приблизительно для 50% высвобождения гистамина); крысиная антиовальбуминовая сыворотка; гистамин, дигидрохлорид; атропин; блокатор Нррецепторов, например, мепирамин (Меру-ramin).

Выделение тучных клеток крысы. Крыс обескровливают под эфирным наркозом, затем вводят внутрибрюшиино по 10 мл безкальциевого буфера для тучных клеток. Энергично массируют живот в течение 90 сек и вскрывают брюшную полость. Пипеткой или шприцем без иглы отсасывают жидкость из полости брюшины. Центрифугируют её 5 минут при 350 g, отбрасывают надосадочную фракцию и суспендируют осадок клеток в 0,5 мл буфера для тучных клеток. Можно использовать буферы другого состава. Для постановки опыта необходимо иметь клетки по меньшей мере от 4 крыс.

Определение количества клеток: на несущее стекло камеры Тома наносят 1—2 капли спиртового раствора нейтрального красного или метиленового синего, дают спирту испариться, затем проводят подсчет клеток обычным способом. Рекомендуется провести подсчет по всей камере, поскольку тучные клетки (ТКл) составляют обычно около 3—6% от общего числа клеток. После подсчета суспензию разводят Са2+-содержащим буфером для ТКл, обычно рекомендуют использовать суспензию 5x105 ТКл/мл. Большего обогащения суспензии ТКл обычно не требуется, но если возникает в этом необходимость, то на 4 мл 38% раствора человеческий сывороточный альбумин в силиконизированной пробирке наносят 2 мл суспензии ТКл в безкальциевом буфере (1,5х106 клеток/мл), центрифугируют 45 минут при 450g. Тучные клетки скапливаются в слое раствора альбумина. Фазу над слоем раствора альбумина отбрасывают. Доводят объем альбуминового слоя до 10 мл буфером для ТКл и центрифугируют 10 минут при 150 g. Тучные клетки осаждаются, их ресуспендируют в подходящем буфере и отмывают еще раз. Доля ТКл в осадке обычно составляет свыше 90%. Известны и другие модификации метода выделения ТКл.

Высвобождение медиаторов из тучных клеток крысы. Высвобождение медиаторов можно вызвать различными способами, например, добавлением препарата 48/80, протамин-сульфата, сыворотки против IgG крыс, IgE-содержащей анти-овальбуминовой сыворотки с последующим добавлением овальбумина, обработкой ТКл реагенсодержащей сывороткой человека с последующим добавлением аллергенов и пр. После 5-минутной инкубации 0,1 мл суспензии ТКл с 0,1 мл исследуемого вещества (в контроле 0,1 мл буфера для ТКл) добавляют 0,1 мл вещества, высвобождающего гистамин, в подходящей концентрации. После 10—30-минутной инкубации при 37°С пробы с ТКл разводят буфером до 2 мл. С каждым контролем и с каждой концентрацией исследуемого вещества ставят по меньшей мере 3 параллельные пробы. После подведения объема проб их центрифугируют 10 минут при 350 g и определяют медиаторы в надосадочной фракции.

Определение дегрануляции тучных клеток. Степень дегрануляции определяют в осадке клеток морфологически.

Тучные клетки крысы

Тучные клетки крысы

а — интактиые; б — с начинающейся дегрануляцией; в — дегранулированные. Окраска нейтральным красным. Объектив 100Х, проектив 8Х, масляная иммерсия.

Осадок ТКл суспендируют в 0,1 мл 2,5% раствора толуидинового синего в 25% уксусной кислоте. В этом растворе клетки одновременно фиксируются и окрашиваются. Микроскопируют 100 тучных клеток. Процент дегранулирован-ных клеток подсчитывают по следующей формуле:

100 [1 — (х — у) (у — z)]

х — совместное действие испытуемого материала и гистаминвысвобождающего фактора;
у — только действие гистаминвысвобождающего фактора; z — контроль (спонтанная дегрануляции)

Выявление медиаторов. Флюориметрическое определение гистамина. К 2 мл надосадочной фракции добавляют 0,4 мл 1 М NaOH, смесь встряхивают на качалке. Добавляют 0,25 мл 0,05% раствора ОФА (см. выше), смесь встряхивают и отставляют на 4 минуты при комнатной температуре. Затем прибавляют 0,2 мл 3 М НСl. Если раствор мутнеет (выпадение в осадок альбумина), его центрифугируют 5 минут при 2000 g. Проводят фотометрическое определение гистамина. Гистамин образует с ортофталевым альдегидом продукт конденсации, который при освещении УФ-лучами (365 нм) флюоресцирует с максимумом около 450 нм. Концентрацию гистамина определяют по калибровочной кривой (гистаминдигидрохлорид, растворенный в 0,1 М HCl, 1—20 мкг/мл). В 1 мг гистамина дигидрохлорида содержится 0,602 мг свободного гистамина. Все исследуемые вещества проверяют на наличие неспецифической флюоресценции, кроме проб с исследуемым материалом и гистаминвысвобождающим препаратом, проводят следующие измерения:

— определение общего содержания гистамина (пробы с соответствующим количеством тучных клеток 5 минут выдерживают на кипящей водяной бане, центрифугируют, определяют гистамин);

— определение спонтанного высвобождения (обработка проб описана выше; ТКл суспендированы в буфере);

— определение степени высвобождения под воздействием только гистаминвысвобождающего препарата;

— определение степени высвобождения под воздействием только исследуемого вещества

Точность анализа может быть еще повышена определением гистамина, остающегося в осадке (кипячение проб, см. выше).

Биологический метод определения гистамина. Метод основан на сокращении изолированного кусочка толстого кишечника морской свинки при добавлении в среду гистамина. Поскольку антианафилактические средства подавляют высвобождение гистамина, результаты относят либо к количеству гистамина, высвобождаемому под воздействием гистаминвысвобождающих препаратов, либо к общему гистамину. Общего гистамина из 5000—7000 ТКл достаточно для субмаксимального сокращения изолированных фрагментов кишечника морской свинки. Чувствительность кусочков кишечника контролируется по степени сокращения со стандартными фармацевтическими препаратами (гистамин Зх10-7 моль/л; ацетилхолин 1,6х10-7 моль/л).

Прочие методы определения гистамина. Обычно достаточно чувствительности методов определения гистамина, описанных выше. В ряде случаев возникает необходимость выявлять гистамин в более низких концентрациях. Имеются многочисленные публикации на эту тему.

Определение медленно реагирующей анафилактической субстанции (МРС-А). МРС-А (лейкотриен) также вызывает сокращение гладкой мускулатуры, поэтому для ее определения можно воспользоваться такой же биопробой, как и для выявления гистамина. Одновременное воздействие гистамина и МРС-А может быть блокировано антигистаминными препаратами (блокаторы H1-рецепторов, например, мепирамин в концентрации 10-6—10-7 моль/л); спонтанные сокращения подавляют атропином (10-6—10-7 моль/л). Поскольку мепирамин легко адсорбируется на стекле, рекомендуется использовать для определения гистамина и МРС-А различные сосуды. Промежутки между отдельными измерениями должны быть не менее 5 минут. Изучение структуры и синтез лейкотриенов могут открыть широкие перспективы для биохимического анализа.

Исследования на базофильных гранулоцитах человека

Этот метод служит для определения сенсибилизации базофильных лейкоцитов у больных с атопией. Вещества, обладающие способностью подавлять высвобождение медиаторов, инкубируют с препаратами лейкоцитов. Следует упомянуть о методе, в котором базофилы нормального донора «нагревают» сывороткой больных с атопией. Добавление соответствующего аллергена приводит к высвобождению медиаторов. Метод требует специальной экстракции гистамина ввиду относительной малочисленности базофилов в периферической крови человека и низкого содержания в них гистамина.

Материалы и оборудование.

Для работы необходимы шприцы на 20 мл, изогнутые иглы; пипетки, микропипетки (10—100 мкл и 100—1000 мкл); пластиковые центрифужные стаканы (10 мл); сосуды для реакции со шлифами (10 мл); центрифуга с бакет-ротором (например, Janetzki Т23); качалки; флюориметр; гепарин (5000 ME).

Растворы

Раствор декстранглюкозы: 3 г декстрана растворяют в 100 мл 0,15 М NaCl; в 25 мл этого раствора растворяют 750 мг D-глюкозы.

Концентрат NaCl: 3,75 г трис-аминометана, 6,95 г NaCl, 0,370 г КС1, дистиллированная вода до 100 мл, рН 7,6 (имеет критическое значение); для употребления концентрат разводят (10 мл доводят дистиллированной водой до 100 мл).

Концентрат кальция: 900 мг СаС12Х2Н20 растворяют в дистиллированной воде (до 100 мл).

Концентрат ЧСА: 33 мг высушенного человеческий сывороточный альбумин растворяют в 10 мл 0,15 М NaCl (хранение не более недели).

Трис-альбуминовый буфер: 10 мл концентрата NaCl доводят дистиллированной водой приблизительно до 98 мл, добавляют 1 мл концентрата ЧСА, доводят объем до 100 мл (свежий раствор готовят каждую неделю).

Трис-АМС-буфер: к 10 мл концентрата NaCl добавляют 1 мл кальциевого н 1 мг магниевого концентрата, доводят дистиллированной водой до 98 мл и прибавляют 1 мл концентрата ЧСА; доводят объем до 100 мл (каждую неделю готовят новый раствор). Кроме того, готовят 7,5 М NaOH, ЗМ NaOH, 0,75 М NaOH, 0,12 М HCl, 1,25 М Н3Р04 (8,25 мл концентрированной НзР04 доводят до 10 мл), 0,05% ортофталевый альдегид (ОФТ) (5 мл ОФТ непосредственно перед употреблением разводят в 10 мл метанола).

Гистаминовый стандарт для построения кривой: 1,66 мл гистамина дигидрохлорида (например, Jenapharm, 1 мг/мл) доводят до 100 мл 0,01 М HCl (соответствует 10 мкг/мл) домина). Гистаминовый стандарт 1 мл разводят до 100 мл 0,12 М HCI (0,1 мкл/мл) и готовят из этого раствора ряд разведений, например, 0,1; 0,08; 0,06 и т. д. до 0,005 мкг/мл.

Выделение лейкоцитов человека. Засасывают в шприц объемом 20 мл 0,04 мл раствора гепарина и 2 мл раствора декстранглюкозы. Отбирают 18 мл венозной крови. После полного перемешивания шприц укрепляют в вертикальном положении в штативе и оставляют на 60 минут для седиментации эритроцитов при комнатной температуре. После чего осторожно слой плазмы с лейкоцитами выпускают через изогнутую иглу в пластиковый центрифужный стакан. Лейкоциты осаждают 2 минуты при 170 g. Сливают плазму. Клетки дважды отмывают 1—2 мл охлажденного трис-альбуминового буфера. Центрифугируют каждый раз по 8 минут при 170 g, следует обращать внимание на полноценное ресуспендирование, например, путем повторных засасываний и выпусканий силиконизированной пастеровской пипеткой. Для дальнейших экспериментов клетки осторожно суспендируют в 12,5 мл трис-АМС.

Взаимодействие лейкоцитов с антигеном. К 2 мл суспензии лейкоцитов добавляют 0,4 мл раствора антигена (оптимальную концентрацию АГ необходимо определить предварительно), инкубируют пробы при 37°С. Каждые 20 мин все пробы перемешивают. Клетки осаждают центрифугированием при 600 g в течение 10 мин, в насадочной фракции определяют гистамин.

Экстракция гистамина. В 10-миллилитровые стеклянные сосуды развешивают по 600 мг NaCl и вносят по 2,5 мл н-бутанола, затем добавляют 1,6 мл бесклеточной надосадочной фракции. Прививают 0,2 мл 3М NaOH и ровно 3 мин энергично встряхивают на качалке. При этом гистамин переходит в фазу бутанола. Сосуды центрифугируют 3 минуты при 900 g. Энергично перемешивают для растворения осадка и снова центрифугируют (8 мин 900 g). По 2 мл бутаноловой фазы переносят в пробирки объемом 10 мл с 1,2 мл 0,12 М HCl и 3,8 мл н-гептана. Закрывают сосуды притертой пробкой и встряхивают в течение ровно 1 мин.

Сосуды оставляют в темноте на холоду до полного расслоения жидкости. В качестве альтернативы можно использовать центрифугирование 5 минут при 600 g. Слой гептана отсасывают водяным насосом, отбирают по 1 мл гистаминсодержащего кислотно-солевого слоя и охлаждают их на ледяной бане. Быстро добавляют 0,4 мл 0,75 М NaOH и 0,12 мл раствора ОФА, перемешивают и инкубируют 40 минут на льду или 4 минуты при комнатной температуре. Добавляют 0,2 мл 1,25 М Н3Р04 и инкубируют еще 20 минут на льду. Проводят фотометрическое определение гистамина, как было описано выше. Нижняя граница чувствительности составляет около 0,001 мкг гистамина в мл. В среднем в 106 лейкоцитов содержится около 1 нг гистамина. Гистамин, высвобождающийся в присутствии АГ, соотносят с общим содержанием гистамина. Учитывают также спонтанное высвобождение гистамина (инкубация суспензии клеток без АГ).

Реакция дегрануляции базофилов.

Метод представляет собой альтернативу аллергениндуцированному высвобождению гистамина из базофилов, к тому же он существенно проще. К числу его недостатков относится плохая воспроизводимость. При использовании проточной цитометрии или автоматизированного анализа изображений метод становится более точным, но и более трудоемким. Не надо забывать, что высвобождение гистамина и дегрануляция не обязательно протекает параллельно. Мы опишем далее очень простую модификацию метода.

Материал и оборудование: шприцы объемом 20 мл, часовые стекла, центрифуга, капилляры, счетная камера Neubauer, микроскоп, трис-NaCl- и трис-АСМ-буферы, 0,025% раствор толуидинового синего в 30% этаноле (рН подведен до 3,4— 3,6 уксусной кислотой).

Проведение эксперимента: в шприц набирают 0,04 мл гепарина (5000 МЕ/мл) и 2 мл 3% раствора декстрана глюкозы в 0,15 М NaCl, 18 мл крови. Эритроциты седиментируют 60 минут при вертикальном положении шприца. Лейкоциты дважды отмывают охлажденным трис-NaCl (по 2 мл), затем суспендируют осадок в 2 мл трис-АСМ. По 0,1 мл этой суспензии переносят в часовые стекла. В контрольные пробы добавляют по 10 мкл трис-АСМ-буфера, в остальные — по 10 мкл раствора аллергена. Пробы инкубируют 20 мин при 37°С. Окрашивают их, добавляя по 270 мкл раствора толуидинового синего (20 минут при комнатной температуре, при легком покачивании). Заполняют смесью обе стороны счетной камеры и подсчитывают интактные базофилы при увеличении 10х40. Оценку результатов проводят по формуле:

Известна модификация с использованием микропланшетов. Аллергены высушивают на стенках планшета в присутствий ионов Са2+ и Mg2+, в контрольных лунках этих ионов нет. Коэффициент дегрануляции базофилов и выделения гистамина составляет 0,74.

Другие методы in vitro

Принцип всех этих тестов один и тот же: нормальные ткани (легкие, кожа, кишечник и т. д.) инкубируют с сывороткой, содержащей реагенты. После внесения антигена и протекания реакции АГ — АТ (антитело) измеряют количество высвободившегося гистамина. Опыты можно ставить среди прочего на ткани легких человека и морской свинки.

Пассивно сенсибилизированные легкие морской свинки. Материалы и оборудование: однополые морские свинки весом около 300 г, 20-миллиметровые шприцы, иглы, пипетки, микропипетки, центрифужные пробирки, эрленмейе-ровские колбы (50 мл), титраторы Takatsy, стеклянные фильтры, мельницы для тканей, ледяная и водяная бани, качалка, центрифуга, овальбумин, коклюшная вакцина.

Растворы: ФСБ с рН 7,0 (6,775 г NaCl, 1,1419 г Na2HP04 (безв.), 0,408 г КН2Р04, дистиллированная вода до 1000 мл); среда для сенсибилизации (рН 7,8; 8,01 г NaCl, 0,176 г СаС12х2Н20, 0,201 г КС1, 0,238 мл 10% раствора MgCl2, 1,0 г глюкозы, трис-буфер с рН 8,2 до 1000 мл); трис-буфер (24,53 г трис, дистиллированная вода до 1000 мл, для получения рН 7,8 смешивают 250 мл раствора трис и 337 мл 0,1 М НСl, доводят дистиллированной водой до 1000 мл; для получения рН 8,2 250 мл раствора трис с 229 мл 0,1 М НСl Доводят дистиллированной водой до 1000 мл).

Получение антисывороток. Морских свинок иммунизируют кристаллическим овальбумином и коклюшной вакциной в качестве адъюванта. Растворяют 10 мг овальбумина в 0,5 мл ФСБ и добавляют 0,5 мл коклюшной вакцины (1,5x1010 клеток). Эту дозу вводят каждому животному внутрибрюшиино. Параллельно 10 мл овальбумина растворяют в 0,5 мл ФСБ, смешивают с 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда и вводят каждому животному внутрикожно в 6—10 точек на животе. Через 28 дней получают сыворотки и хранят их в замороженном состоянии.

Пассивная сенсибилизация легких морской свинки. Забивают животных декапитацией, обескровливают, извлекают легкие через разрез грудной клетки. Для постановки опыта необходимо 3—4 животных. Легкие осторожно отмывают охлажденной средой для сенсибилизации и на мельнице измельчают до кусочков 3x0,25x0,25 мм. Кусочки ткани помещают на 2 слоя фильтровальной бумаги на воронку со стеклянным фильтром и отмывают охлажденным раствором для сенсибилизации, затем переносят их в 50 мл эрленмейеровские колбы, добавляют 15 мл разведенной антиовальбуминовой сыворотки п инкубируют 2 часа при 37°С при постоянном покачивании и аэрации. Оптимальное разведение сыворотки определяют для каждой новой партии (0,125% раствор овальбумина должен вызывать по меньшей мере 50% высвобождение общего гистамина). Обычно разведение составляет 1 : 2—1 : 4. Антисыворотку разводят раствором для сенсибилизации, кусочки легких 4—5 раз отмывают средой для сенсибилизации и один раз средой для высвобождения гистамина.

Реакция сенсибилизированных легких с антигеном. Для получения по возможности одинаковых количеств ткани в качестве стандарта пользуются объемом лунки титратора Takatsy. Отдельные пробы переносят в центрифужные пробирки с 1 мл среды для высвобождения. При медленном покачивании инкубируют 5 минут при 37 °С. Затем вносят 2,5 мг овальбумина в 1 мл среды для высвобождения. Инкубируют еще 15 минут. При фармакологических исследованиях препарат растворяют до желаемой концентрации в среде для высвобождения и вносят его в пробирку с тканью за 5 минут до внесения антигена. Реакцию останавливают, охлаждая пробу на ледяной бане в течение 10 минут. Центрифугируют пробы 10 минут при 1000 g. Надосадочную фракцию проверяют на высвободившийся гистамин любым известным методом. Для определения общего гистамина пробы инкубируют 5 минут на кипящей бане, центрифугируют, исследуют надосадочную фракцию.