Главная


Мобильный стильный ноутбук. Настольный дешевые ноутбуки.

Корреляция с аминокислотной последовательностью и пространственной структурой

При сравнении сывороточных антител с миеломными белками к одной и той же антигенной детерминанте часто обнаруживалось наличие у них общих идиотипов и сходство в специфичности связывания. Уже на ранних этапах изучения сывороточных антител к описанным выше антигенам выяснилась относительная ограниченность репертуара В-клеток, а также тот факт, что структуры вариабельных областей антител и миеломных белков, имеющих общий идиотип, скорее всего, идентичны. Это предположение нашло подтверждение при определении N-концевых аминокислотных последовательностей поликлональных антител к декстрану и ФХ, которые оказались весьма похожими на аминокислотные последовательности миеломных белков с тем же идиотипом. Однако более детальное исследование репертуара антител стало возможным лишь с появлением техники моноклональных антител. Это позволило изучить структуру и идиотипы антител, секретируемых индивидуальными клонами гибридомных клеток, и выяснить молекулярные основы разнообразия антител.

С помощью такого подхода были изучены антитела к нескольким антигенным детерминантам. Наиболее четко идиотипические детерминанты были идентифицированы у антител, специфических к декстрану. Был получен набор мышиных (BALB/c) гибридом, секретирующих антитела (IgMA,) указанной специфичности. Результаты определения аминокислотной последовательности вариабельных областей тяжелых цепей приведены на рисунке.

Структура и идиотипы мышиных антител к а-декстрану.

В верхней части рисунка приведены аминокислотные последовательности VH-областей миеломных белков IgMX, специфичных к декстрану,
(М104Е и J558) и IgMX-антител этой же специфичности, образованных гибридомами (Hdex 1-10). Аминокислотные остатки,
отличающиеся от таковых у иммуноглобулина М104, обозначены с помощью однобуквенных сокращений. Отмечены участки VH-области,
кодируемые генами VH, D и JH. Показаны также гипервариабельные участки VH-области белков (hV1, hV2, hV3).
Можно заметить, что способность этих белков связываться с антителами против IdX коррелирует со структурой hV2, а с антителами
против Id — со структурой hV3. На нижней части рисунка изображена построенная с помощью компьютера пространственная модель вариабельных доменов
белков М104 и J558. Эти белки различаются только аминокислотными остатками, кодируемыми D-сегментами.
Аминокислоты, кодируемые JH-сегментами, окрашены в серый цвет. Участки связывания антигена смотрят вниз налево.
Черным цветом показаны аминокислоты, участвующие в образовании идиотипических детерминант.

Распределение вариабельных участков в структуре этих молекул согласуется с тем фактом, что Ун-области кодируются тремя генами, VH, D и JH. Обнаружена гомология для первых 99 аминокислотных остатков всех белков. Значительная гетерогенность характерна для двух следующих аминокислотных остатков, 100 и 101; за ними идет участок (102 — 117), отличающийся незначительной вариабельностью. У двенадцати изученных иммуноглобулинов обнаружены четыре варианта V- сегмента, девять вариантов D-сегмента и три варианта J-сегмента, VH-домены антител к декстрану образуются в результате случайного объединения указанных сегментов.

Миеломные белки М104 и J558 различаются лишь двумя аминокислотами, кодируемыми D-сегментами: остальная часть VH-области и все Vλ1,гобласти полностью идентичны. Поэтому следовало бы ожидать, что индивидуальные идиотипические детерминанты этих белков должны коррелировать со строением D-сегментов, что и было экспериментально подтверждено. На рисунке обобщены данные об идиотинах антител к декстрану. Три из 12 белков экспрессируют IdI (М104)-детерминанту; в положениях 100 и 101 этих белков находятся YD, YD и AD. Ни в одном из остальных изученных иммуноглобулинов в этих положениях названных аминокислот нет. Два белка имеют идиотоп IdI (J558), причем у обоих в положениях 100 и 101 находятся RY. Еще у двух белков эта же детерминанта выражена слабо: и у того и у другого в D-области присутствуют остатки NY. Другие антидекстрановые белки не имеют Y в положении 101. Таким образом, оба IdI-идиотопа коррелируют с двумя аминокислотами, занимающими в полипептидной цепи положения 100 и 101.

Сейчас выяснено расположение детерминанты IdX. У десяти из изученных иммуноглобулинов эта детерминанта полностью активна. У одного она слабо выражена и еще в одном случае эта детерминанта вообще не обнаруживается. Последний белок отличается от всех остальных двумя участками, D и hV2. Все десять IdX-положительных белков имеют идентичную структуру в hV2, но отличаются по D-участку. Поэтому прослеживается четкая корреляция IdX со структурой hV2, в частности с наличием двух аминокислот NN в положениях 54 и 55 и (или) присутствием углеводной цепи. У белка (Hdex 8) со слабоактивной IdX- детерминантой положения 54-55 заняты SN, а у IdX- отрицательного иммуноглобулина (Hdex 10) — КК; у Hdex 10 кроме этого, отсутствует углеводная цепь. Таким образом, наличие детерминанты IdX связано со структурой hV2, а обеих IdI-детерминант — с hV3. На рисунке изображены полученные с помощью компьютера модели вариабельных до менов белков М104 и J558. Стрелками показаны участки, коррелирующие с IdX- и IdI-детерминантами. Заслуживает внимания тот факт, что оба участка представляют собой выступающие в раствор области молекулы. D-область выдается из нижней части антиген-связывающего участка, причем на краю ее находится IdX. Из приведенных данных не следует делать вывод об участии в образовании идиотипических детерминант лишь двух аминокислотных остатков. На это, в частности, указывают результаты изучения рекомбинаций Н- и L-цепей, показавшие, что определенный вклад в активность вносит и А,-цепь. Однако совершенно очевидно, что идентифицированные аминокислотные остатки играют решающую роль в активности идиотипических детерминант.

Еще один идиотоп был обнаружен в участке hV2. Поттер и сотр. исследовали ряд миеломных белков мышей BALB/c, специфических к β(1 → 6)-D- галактану. Знание аминокислотных последовательностей этих белков и данные об их взаимодействии с антиидиотипическими антисыворотками позволили установить корреляцию между идиотипическими детерминантами и структурой. Антиидиотипическая антясыворотка к белку Х24 [анти-IdI(Х24)] не взаимодействовала с восемью другими галактансвязывающими белками. При сравнении аминокислотных последовательностей иммуноглобулинов, реагирующих и не реагирующих с IdI (Х24), было показано, что наиболее вероятная локализация детерминанты — это положение 53 тяжелой цепи. Таким образом, IdI- детерминанта ассоциирована с hV2.

Данные о первичной структуре мышиных моноклональных иммуноглобулинов позволили также объяснить разнообразие антител к ФХ. Были исследованы три семейства анти-ФХ-антител, сходных по идиотипическим характеристикам и по антигенсвязывающим свойствам с миеломными белками Т15, М511 и М603. Как и предполагалось на основании данных изоэлектрофокусирования, эти семейства имеют разные L-цепи. В то же время их L-цепи очень схожи с L-цепями соответствующих белков Т15, М511 и М603, а иногда идентичны им. Интересно, что тяжелые цепи всех трех семейств, по-видимому, произошли от одного и того же сегмента Ун-гена, кодирующего VH-область Т15. По-видимому, соматические мутации ответственны за незначительные изменения структуры в отдельных районах V-области, поскольку в геномной ДНК мышей BALB/c найден лишь один функциональный ген, ответственный за специфичность к ФХ. Структура этого гена идентична структуре, предсказанной для гена белка Т15. Дополнительный вклад в разнообразие генов иммуноглобулинов может вносить также и конверсия генов.

Важно было бы выяснить, является ли идиотип Т15 маркером VH или VL. Генетически экспрессия этого идиотина сцеплена с аллотипом тяжелой цепи, однако рекомбинации Н- и L-цепей в этом случае еще не изучены. Из данных о первичной структуре следует, что белки с одинаковыми Ун-областями, но разными L-цепями могут быть как Т15-положительными, так и Т15-отрицатель- ными. Скорее всего, для активности Т15 важное значение имеют детерминанты как VH-, так и VL-областей. Более точно локализовать какие-либо идиотипические детерминанты антител, специфичных к ФХ, пока не удалось.